J Virol. | 冷冻电镜揭示单纯疱疹病毒HSV-1复制起始蛋白UL9的分子机制

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单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是全球感染率最高的人类病毒之一，可导致唇疱疹等常见疾病，严重时引发病毒性脑炎。病毒感染后终身潜伏于神经节，免疫力下降或压力增大时易复发。目前的抗病毒药物（如阿昔洛韦）虽能抑制病毒复制，但无法清除潜伏病毒。开发新一代抗疱疹药物，亟需深入阐明病毒复制的分子机制。

HSV-1基因组约152 kb，其复制依赖七种核心蛋白组成的复制机器，包括UL9（起始位点结合蛋白OBP）、ICP8（单链DNA结合蛋白SSBP）、UL30/UL42（DNA聚合酶复合物）以及UL5/UL8/UL52（解旋酶-引发酶复合物）。UL9作为起始关键因子，负责特异性识别病毒基因组上的复制起始位点（oriS和oriL），解开双链DNA，并招募下游复制蛋白启动复制。长期以来，由于缺乏高分辨率结构信息，UL9的工作机制一直悬而未决。

近日，深圳湾实验室马军课题组与合作者在《Journal of Virology》发表题为“Structure and mechanism of the HSV-1 origin-binding protein UL9”的研究论文。研究团队利用冷冻电镜（Cryo-EM）单颗粒分析技术，解析了HSV-1复制起始位点结合蛋白UL9的全长高分辨率三维结构，并结合系统的体外生化与酶学实验，揭示了UL9的二聚化组装、复制起始位点识别以及与单链DNA结合蛋白ICP8的别构调控机制，为理解疱疹病毒DNA复制起始提供了原子水平的全新认识。

核心研究亮点
1. 揭示UL9的二聚体结构基础
冷冻电镜结构显示，UL9为同源二聚体，与文献报道其以二聚体形式发挥功能一致。根据其结构特征，UL9可分为 N端Helicase结构域（包括RecA1、RecA2和Bridge三个亚结构域）和C端结构域（包括CDD、SAP和C-tail三个亚结构域/区域）。两个亚基通过三类互作界面（Type I、II、III）紧密结合，总界面面积约3,815 Å2。其中，Type I为两个C端二聚化结构域（CDD）的对称相互作用；Type II涉及一个亚基的CDD与对侧亚基解旋酶结构域的接触；Type III则由C-tail作为“分子胶水”桥接对侧亚基的多个结构域。UL9的该二聚化模式与SV40大T抗原、HPV E1等通过解旋酶结构域形成六聚体的机制显著不同，体现了疱疹病毒特有的进化策略。


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2. SAP结构域介导序列特异性DNA识别
通过对UL9在apo和DNA结合状态下的结构比较，以及对UL9-DNA复合物的结构分析，结果显示UL9通过C端结构域内一个约50个氨基酸的结构域，实现对复制起始位点的精准识别。结构相似性检索结构显示，该结构域隶属于SAP结构域。SAP结构域（得名于SAF-A/B、Acinus和PIAS）是一种保守的螺旋-转角-螺旋折叠模块，它广泛存在于参与染色质组织、转录调控、DNA修复和RNA代谢的蛋白质中，并因其DNA/RNA结合特性而被充分研究。在未结合DNA的apo状态下，SAP结构域呈柔性无序状态；结合oriS DNA后，则发生有序化构象转变，并与CDD共同形成稳定的DNA识别几何构型。其中，关键碱性残基与DNA磷酸骨架形成静电相互作用，疏水残基参与碱基堆积。点突变结合微量热泳动（MST）实验验证了这些残基的关键作用。值得注意的是，在解析的UL9-DNA复合物结构中，DNA结合仅由SAP结构域承担，而非传统观点认为的解旋酶结构域。据此，研究进一步提出，解旋酶结构域可能存在第二（次级）结合位点，与SAP结构域协同参与起始位点的解旋。

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3. UL9与ICP8相互作用的结构基础
UL9 需招募ICP8协同完成起始位点双链的解旋，但两者相互作用的精确机制此前并不清楚。本研究通过构建一系列UL9的截短体，并利用体外Pull-down实验发现，仅含C端结构域（UL9CTD）即可与ICP8发生强结合，而全长UL9（UL9FL）的结合反而较弱。结构分析表明，在全长二聚体中，C-tail被对侧亚基的解旋酶结构域部分包裹，可能遮蔽了ICP8主要结合位点，造成全长结合弱于截短体的现象。删除C-tail的突变体基础ATPase活性升高，但丧失了对ICP8的响应能力，且解旋酶活性显著降低。上述结果证实，C-tail在UL9二聚化、ICP8结合及别构调控中发挥核心作用。

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4. 提出UL9-ICP8别构调控模型

基于结构和生化实验的结果，研究提出UL9-ICP8协同调控模型：在静息状态下，UL9的C-tail被包裹形成自抑制构象，酶活处于低水平状态；结合oriS后，C-tail局部瞬时释放，诱导 ICP8 的初始、低亲和力弱结合。随后，ICP8结合与ATP水解形成正反馈，驱动大范围构象重排，二聚体解离为高活性单体，完成起始位点的解链；最终，UL9和暴露的单链DNA招募下游复制酶组分，启动全基因组的持续复制。

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总结与展望

本研究通过冷冻电镜结构解析，结合系统生化与酶学验证，获得了HSV-1复制起始蛋白UL9的高分辨率三维结构，阐明了其二聚化结构基础、SAP结构域介导的DNA特异性识别机制及ICP8的别构调控模型。这一研究丰富了疱疹病毒DNA复制起始机器的结构生物学认识，为理解疱疹病毒基因组复制起始机制提供了全新视角，也为开发新型抗疱疹病毒药物提供了重要思路。

深圳湾实验室特聘研究员马军和中国科学院生物物理研究所章新政研究员为论文共同通讯作者。中国科学院生物物理研究所博士生黄翠清和深圳湾实验室客座学生吴海强为论文共同第一作者；深圳湾实验室研究助理宋金妙亦参与了本项研究工作。该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院战略性先导科技专项、深圳湾实验室启动基金以及北京市科技新星计划等项目支持。


文章全文链接：

https://journals.asm.org/doi/epub/10.1128/jvi.00271-26



文章来源 | 马军课题组